流式細胞儀簡介

1 流式細胞術的概念及其發展歷程
1.1 流式細胞術的基本概念
流式細胞儀（FCM）是一種對高速線性流動細胞或生物顆粒進行快速定量測定和分析的設備，主要包括樣品液流技術、細胞計數與分選技術、計算機數據采集與分析技術。流式細胞術以流式細胞術為基礎，是流體力學、激光技術、電子工程、分子免 疫學、細胞熒光化學、計算機等知識綜合應用的結果。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。其特點是：測量速度快，被測人群大，多參數測量，即與同一細胞的理化特性相關的多參數測量，具有統計上的有效性。
1.2 流式細胞術發展簡史
流式細胞術*早的原型誕生于1934年，Moldavan提出了讓懸浮的單個紅細胞流過玻璃毛細管，在明場用顯微鏡計數，并用光電器件測量的想法。 1953 年，Crossland-Taylor 基于在圓管中流動的牛頓流體設計了流動室。設計了光電檢測設備和細胞分選裝置，并實現了計算機與流式細胞儀和多參數數據完成。記錄分析，開創細胞免 疫熒光染色檢測技術，推廣流式細胞術臨床應用。近20年來，隨著流式細胞術及其檢測技術的進步，人們越來越多地致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發等工作，以擴大FCM的應用領域和使用效果。
根的《流式細胞術原理及應用》是迄今為止關于流式細胞術及其技術*詳細、*透徹的中文書籍。本書詳細介紹了流式細胞術的歷史、結構、原理、技術指標等，并舉例說明了其在醫學和生物工程中的應用。非常適合從事該領域專業研究的人士。本書自13年前出版以來，基本不涉及植物流式細胞儀檢測技術。也只為對于有一定流式細胞術基礎知識的人來說，這本書太復雜太深奧了。謝曉梅主要介紹了流式細胞術在生物工程中的應用。楊銳總結了流式細胞術的工作原理，并簡要提到了流式細胞術的應用。本文在分析了這三篇論文或文章的優缺點后，用比較流行的語言介紹了掌握流式細胞儀檢測技術必須了解的一些原理，并對目前市場上的主流機型進行了客觀的性能總結。
2 流式細胞儀工作原理及技術指標
2.1 流式細胞儀工作原理
流式細胞儀除電源外，主要由四部分組成：流室和液流系統：激光源和光學系統；光電管及檢測系統；計算機和分析系統，其中流動室是儀器的核心部件。這四個組件共同完成信號產生、轉換和傳輸的任務。
2.1.1 信號產生、轉換和傳輸
在壓力作用下，鞘液管內的鞘液不斷被壓入流腔，形成穩定連續的液流，保證樣品液的穩定性。地面在鞘液流的軸線上并通過激光單細胞形式的直線照射區域。激光照射區域也稱為測量區域，是指液體流與激光束垂直相交的點。當細胞攜帶熒光素標記物通過激光照射區域時，會產生代表細胞內不同物質和不同波長的熒光信號。這些信號以細胞為中心以360°立體角發射，產生散射光和熒光信號。散射光不依賴于任何細胞樣品制備技術，因此稱為細胞的物理參數或固有參數。散射光包括前向角散射和尋向角散射。前向角散射與測量的細胞直徑的平方密切相關。定向角散射光對細胞膜、細胞質和核膜的折射率更敏感，可以提供細胞內精細結構和顆粒特性的信息。還有兩種類型的熒光信號；一種是細胞自身在激光照射下發出的微弱熒光信號，另一種是經過熒光素特異性標記的細胞被激發和照射后得到的熒光信號。在免 疫分析中，往往需要同時檢測兩種以上波長的熒光信號，因此使用分色鏡或分色光譜儀來有效分離各種熒光。
熒光染色的細胞在被合適的光激發后測量其熒光，通過光電轉換器將其轉換為電信號。*常用的光電轉換器是光電倍增管（PMT）. PMT輸出的電信號需要經過放大后才能輸入到分析儀器中。流式細胞儀中通常有兩種類型的放大器。一種是線性放大器，其輸出信號與輸入信號具有線性關系。線性放大器適用于小范圍變化的信號和代表線性生物過程的信號，例如 DNA 測量。另一種是對數放大器，輸出信號和輸入信號有共同的對數關系。對數放大器常用于免 疫學測量。放大后的電信號傳輸到計算機，再通過模數轉換器傳輸到微機處理器，形成數據文件，存儲在計算機上。保存在電腦上的數據離線后可以進行處理和分析。
2.1.2 流式細胞儀分選原理
并非所有流式細胞儀都具有分選功能。流式細胞儀的分選功能由完成。從噴嘴噴出的液流柱在電信號的作用下振動并破碎形成均勻的小液滴。邏輯電路根據選定的參數判斷是否進行排序，然后充電電路對選定的電芯進行充電。帶電液滴攜帶細胞通過靜電場，然后偏轉并落入收集器中。使用不同直徑的噴嘴并改變液體流速可能會改變分選效果。從參數確定到邏輯選擇再到脈沖充電需要一定的延遲時間。準確確定延遲時間是決定分選質量的關鍵，可根據具體要求適當調整。
2.1.3 數據展示與分析
數據處理主要包括數據展示和分析。單參數直方圖是*常用的圖形顯示形式，既可用于定性分析，也可用于定量分析。單參數直方圖是由 X 和 Y 方向組成的二維平面圖。橫坐標X為被測熒光或散射光的強度，用“通道號”（Channel No.）表示。選擇的放大器類型不同，規模也不同。縱坐標 Y 通常表示要測試的細胞的優良數量。通常情況下，數據分析得到的圖形是一個或多個峰的圖形。圖表的解釋應該詳細分析。
除了直方圖，數據顯示方式還包括二維點圖、二維等高線圖、偽三維圖和列表方式。二維點圖也是一種常用的數據顯示類型。它顯示了兩個獨立參數與細胞的相對數量之間的關系。這也是一個二維的計劃。由線確定，點的位置表示細胞和粒子兩個測量參數的值。二維點圖提供的信息量大于單參數直方圖。
數據分析方法大致可以分為兩大類：參數方法和非參數方法。當被測試的生物系統可以使用某種數學模型時，通常會使用參數方法。非參數分析方法不需要對顯示的圖像做任何假設，也不需要使用數學模型。分析程序可以簡單也可以復雜。非參數分析方法常用于臨床醫學。
2.2 流式細胞儀性能技術指標
流式細胞儀性能的技術指標主要包括熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指兩個相鄰峰之間的*小距離，通常用變異系數（CV值）表示。市面上主流機型出廠時熒光分辨率應小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器檢測*小熒光強度的能力。它通常用熒光微球上可以測量的*小 FITC 分子數來表示。目前儀器可以達到1000左右。儀器工作時，樣品濃度一般在105-107個細胞/毫升之間。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒可分析或分選的粒子數。一般分析速度為5000～10000，分選速度控制在1000以下。
流式細胞儀測得的數據是一個相對值，因此系統需要在使用前進行校準或校準。流式細胞儀的校準有兩個目的，即儀器的準直調整和定量刻度。通常，標準微球作為非生物標準樣品，雞紅細胞作為生物標準樣品。