1、操作時(shí)間盡量短，操作步驟盡量少。無(wú)論是從培養(yǎng)箱拿出來(lái)，到trypsin消化，到離心等，這些對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，都屬于是stress。因此，我們要縮短整體的操作時(shí)間，減少操作步驟。

a）對(duì)于好消化的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，不需要將細(xì)胞消化到漂起來(lái)、加培養(yǎng)基終止后離心，可以在消化到差不多快要脫落的時(shí)候，移除大部分trypsin，稍候片刻，直接加培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打下來(lái)，省去離心步驟。殘余的trypsin由于含量很低，所以不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何影響。

b）對(duì)于難消化的細(xì)胞，我倒是建議用無(wú)鈣鎂PBS洗滌一次后，加入稍微多一點(diǎn)trypsin置37度消化至脫落（一晃細(xì)胞就掉下來(lái)的那種），然后再加培養(yǎng)基終止、離心。這么做的道理是，細(xì)胞消化不，勢(shì)必會(huì)增加吹打輔助脫落的次數(shù)。而吹打次數(shù)越多，細(xì)胞活性越差。

值得注意的是，有些特殊的細(xì)胞，不可以使用trypsin作為消化液。比如我有一株純由EGFRvIII基因驅(qū)動(dòng)、不含其他生長(zhǎng)因子信號(hào)通路基因突變的腫瘤細(xì)胞，用trypsin消化之后，形態(tài)會(huì)發(fā)生劇變，要等兩天才能恢復(fù)。經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原來(lái)是trypsin剪切了EGFRvIII（室溫2分鐘就干掉20%的EGFRvIII）。而使用trypLE就不會(huì)有這種現(xiàn)象，相應(yīng)地，流式數(shù)據(jù)提示僅丟失5%不到的信號(hào)。所以遇到比較脆的細(xì)胞，比如干細(xì)胞和一些腫瘤PDC，要測(cè)試一下何種消化液可用。

2、明白每一種細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。我看過(guò)無(wú)數(shù)protocol使用PBS做細(xì)胞重懸、染色等活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的緩沖液。短時(shí)間的話，這并沒(méi)有什么問(wèn)題。但是，經(jīng)典的PBS配方中并不含葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，細(xì)胞在PBS中待的時(shí)間長(zhǎng)的話，活性會(huì)受到極大的影響。我曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別用PBS和HBSS（后者含葡萄糖）重懸同一份細(xì)胞樣品，上流式進(jìn)行單細(xì)胞分選到96孔板。*后，HBSS組超過(guò)50%的孔長(zhǎng)出克隆，而PBS組則低于5%。對(duì)于一些非常敏感的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，比如神經(jīng)元，連洗滌都要使用含糖及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的buffer。