纖維素酶的活性測定-纖維素酶的發(fā)酵

纖維素酶產(chǎn)生菌的初篩主要以菌株在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈的有無和大小為指標(biāo)，但具體到篩選優(yōu)良和高產(chǎn)菌株，并對菌株產(chǎn)纖維素酶的能力進(jìn)行定量，需要采用DNS法對纖維素酶進(jìn)行活性測定。

、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

原理：DNS（3，5-二硝基水楊酸）在堿性條件下，與還原糖起經(jīng)沸水浴后可生成棕紅色的氨基化合物，因還原糖含量的不同其生成物的量也有差異，導(dǎo)致顏色深淺不，可通過其在550nm處的吸光度來判斷生成物的量，進(jìn)步可換算成溶液中還原糖的量。

方法：取8支試管，分別加入0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，均補(bǔ)水至2mL，再加入3.0mLDNS試劑混合均勻，沸水浴中加熱5min，取出用流動水冷卻后自然冷卻至室溫，稀釋定倍數(shù)后于550nm波長處測定OTD值（表6-1），以O(shè)Dt值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

二、活性測定

取待測菌株的液體產(chǎn)酶發(fā)酵液，于5000r/min條件下離心20min，上清液即為粗酶液。

1.內(nèi)切纖維素酶（EG）的測定

取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5mL于試管中，再加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）的檸棕酸緩沖液（pH5.0，0.05mol/L）l.5mL，50C恒溫水浴30min后，按DNS法測定還原糖含量，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，以高溫滅活的粗酶液作為對照。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每30min產(chǎn)生1.0ug還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

2.外切纖維素酶（CBH）的測定

取適當(dāng)稀釋的粗醇液0.5mL于試管中，加入50mg 脫脂榴，再加入1.5mL檸檬酸緩沖液（pH5.0，0.05mol/L），50℃水浴保溫24b后按DNS法測定還原糖，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，以高溫滅活的粗酶液作為對照。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每24h產(chǎn)生1.0ug還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

3.濾紙酶活力（FPase）的測定

取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5mL于試管中，加入1.5mL檸檬酸緩沖液（pH4.5，0.05mol/L），再加入濾紙條50mg，50℃水浴保溫1h后取出，按DNS法測定還原糖，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，以高溫滅活的粗酶液作為對照。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每1h產(chǎn)生1.0p8還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

三、說明

日前，測定纖維系醇活力的方法基本采用DNS法，但是不同文獻(xiàn)的具體測定過程有定的差異，對酶活力的定義也有所不同，具體可參考相關(guān)文獻(xiàn)。