一、取樣準(zhǔn)備

（1）取樣時(shí)該樣品必須是代表該批產(chǎn)品情況。

從車(chē)間取回樣品冷凍品按要求進(jìn)行解凍，干燥食品可放在常溫冷暗處，易腐和冷卻樣品應(yīng)放入10℃環(huán)境。冷凍樣品來(lái)不及檢驗(yàn)應(yīng)放入-15℃以下冰箱內(nèi)，待檢樣品存放時(shí)間不應(yīng)超過(guò)36h。

（2）解凍

原則上冷凍樣品取出后，按包裝原樣在室溫下自然解凍；也可在0-4℃環(huán)境解凍，時(shí)間不超過(guò)18小時(shí)；也可在溫度不超過(guò)45℃環(huán)境中解凍，時(shí)間不超過(guò)15min。如果這些解凍條件對(duì)有些產(chǎn)品尤其是大塊冷凍品達(dá)不到解凍的目的，可參照以下解凍時(shí)間。

① 100-300g調(diào)理食品45℃解凍10min左右；

② 500g以下冷凍蔬菜30℃解凍40min左右；

③ 500g以上冷凍樣品37℃解凍1h左右；室溫下解凍2h左右。

※ 備注：將樣品解凍到半解凍狀態(tài)（用剪刀能剪開(kāi)的程度）。

（3）操作環(huán)境

試驗(yàn)前用臭氧發(fā)生器/紫外線將工器具、無(wú)菌間滅菌消毒，達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)。

操作試驗(yàn)的準(zhǔn)備物品均質(zhì)袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無(wú)菌盆等物品是否齊全。

二、取樣及樣液制備

1 樣品標(biāo)識(shí)

將樣品從污染程度低到污染程度高的順序排列，相應(yīng)的作一一對(duì)應(yīng)性標(biāo)識(shí)，其中按細(xì)菌數(shù)平皿、大腸菌群平皿、平皿的順序，2-3個(gè)樣品一摞。

2 檢樣采取

先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑）

（1）固體樣品

① 75%酒精棉消毒開(kāi)啟部位及其周?chē)儆没鹧鏈缇募舻都糸_(kāi)

② 在電子稱上放入無(wú)菌均質(zhì)袋（手不要碰及袋口）去皮調(diào)整至零，

③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品

④ 加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液（開(kāi)蓋瓶塞時(shí)瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過(guò)1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后，均質(zhì)或待均質(zhì)

⑤ 擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中并將樣品封口。

⑥將袋子折疊后用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)約30秒作為樣液，此時(shí)均質(zhì)袋內(nèi)要設(shè)定為不含空氣（可根據(jù)樣品不同情況相應(yīng)調(diào)整均質(zhì)時(shí)間），

（2）液體樣品

①冷凍樣品*解凍后使用。

②75%酒精棉消毒開(kāi)啟部位及其周?chē)儆没鹧鏈缇募舻堕_(kāi)啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25ml。

③余同上。

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

①將樣品混合均一化。

②75%酒精棉消毒開(kāi)啟部位及其周?chē)儆没鹧鏈缇募舻堕_(kāi)啟，以無(wú)菌匙采取混合后樣10g。

③加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液，開(kāi)蓋瓶塞時(shí)瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過(guò)1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。

④余同上。

※ 備注：

（1） 從罐頭取樣時(shí)，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點(diǎn)火燃燒后開(kāi)罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。

（2） 75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內(nèi)有明顯的污物應(yīng)立即更換。

（3） 火焰滅菌的剪刀、鑷子通過(guò)火焰4-5s即可。

三、稀釋方法

①?gòu)木|(zhì)袋準(zhǔn)確吸取樣液1mL，

②沿管壁徐徐接種到含9mL磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻?yàn)?：100稀釋液。（勿使吸管伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。）

③重復(fù)該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。

④為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。

※ 備注：

（1） 樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性。

（2） 車(chē)間產(chǎn)品根據(jù)加工工藝或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)選擇合適的稀釋倍。（尤其注意蔥、姜、蒜等無(wú)加熱類(lèi)產(chǎn)品、保存實(shí)驗(yàn)、外調(diào)新廠家、樣品開(kāi)發(fā)、原料等樣品）。

四、樣液接種方法：

① 從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時(shí)在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至快速通過(guò)火焰，并且排空吸管里殘留的水，

② 以吸管插入均質(zhì)袋樣液內(nèi)的深度不超過(guò)2.5cm處，準(zhǔn)確吸取樣品勻液（吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應(yīng)先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其離開(kāi)液面并貼在袋內(nèi)將液體調(diào)至所要求的刻度。）1mL、1mL、1mL、0.2mL無(wú)菌操作分別以2～4s內(nèi)*注入已標(biāo)識(shí)清楚的細(xì)菌數(shù)、大腸菌群、EC以及平皿中（EC接種后應(yīng)迅速震蕩均勻）

③  如果某一樣品液在接種前放置時(shí)間超過(guò)3 min，應(yīng)重新均質(zhì)。

④ 為了驗(yàn)證稀釋液、培養(yǎng)基、平皿、吸管等器具無(wú)菌需做空白對(duì)照。

五、傾注倒藥方法

右手持培養(yǎng)基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開(kāi)啟成一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上；也可將平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打開(kāi)培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻

※備注：

（1）培養(yǎng)基在50-60℃水浴中的保溫時(shí)間不要超過(guò)4h。

（2）從采樣開(kāi)始到分注培養(yǎng)基操作限于20min以內(nèi)。

（3）涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易發(fā)生菌落擴(kuò)散，有冷凝水不利于細(xì)菌分離并且會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌繁殖使結(jié)果失真；干燥過(guò)分，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基裂開(kāi)，不能用；干燥合適，則樣液吸收*、快）。

（4）細(xì)菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后應(yīng)盡快將平皿內(nèi)的樣液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合，否則細(xì)菌不容易分散。混合方法是將平皿傾斜和旋轉(zhuǎn)使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。

六、培養(yǎng)

●  平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中(每垛最多堆放6個(gè)平皿，平皿間要留有空隙進(jìn)行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致)，按所規(guī)定的時(shí)間溫度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過(guò)15％

●  斜面、高層斜面、液體培養(yǎng)基立在試管架上放入恒溫培養(yǎng)箱中，按所規(guī)定的時(shí)間溫度進(jìn)行培養(yǎng)

七、計(jì)數(shù)判定及注意事項(xiàng)

●由于細(xì)菌種類(lèi)繁多，差別甚大。計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于平皿背面或正面（菌落計(jì)數(shù)器）仔細(xì)觀察。必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏尤其是平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。

●計(jì)數(shù)方法參照SN/T 0168-2015方法。

●稀釋度低的培養(yǎng)皿，微生物菌落和食品碎渣很難區(qū)分，一般以食品碎渣沒(méi)有光澤，不夠光滑來(lái)識(shí)別。

●為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。

● 必要時(shí)，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在平板計(jì)數(shù)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100ml加入1ml 0.5%TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

● 在發(fā)酵試驗(yàn)中，發(fā)酵倒管的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡，或發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡，都應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的發(fā)酵有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳?xì)馀菀粯樱磻?yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。如果只是搖起的氣泡，就是陰性。