植物(plant)組織培養滅菌及無菌操作控制技術(technology)

 
［目的要求］認識各類滅菌(Sterilization)劑，掌握其性質、使用(use)方法；通過(tōng guò)在超凈工作臺上進行無菌操作訓練，使學生初步掌握組織培養的無菌操作技術，養成無菌操作習慣。［知識模塊］滅菌技術、無菌操作技術［重點］植物組織培養各類設備及人員消毒的方法［難點］無菌操作規程［方法］采用一體化教學方法，教師借用多媒體進行簡要的講授后學生分組操作實踐。 
　　一、植物組織培養滅菌1．濕熱滅菌（培養基）：在制備后的24h內完成滅菌工序。⑴對高壓滅菌后不變質的物品，可以延長滅菌時間或提高壓力。⑵對于一些布制品，洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。⑶高壓滅菌前后的培養基，其pH值下降0.2-0.3單位，要控制好滅菌的溫度和時間。⑷高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。⑸培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。 注意事項：防止高壓滅菌培養基變化的方法
　　(1)經常注意搜集有關高壓滅菌影響培養基成分的資料，及時采取有效措施。壓力蒸汽滅菌器具有造型新穎美觀、結構合理、功能齊全、加熱迅速、滅菌*等優點。適用于醫療、科研、食品、等單位對手術器械、敷料、玻璃器皿、橡膠制品、食品、藥液、培養基等物品進行滅菌。
　　(2)設計(design)培養基配方時盡量采用效果類似的穩定試劑(Reagent)并準確掌握劑量。如避免使用果糖和而用，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
　　(3)配制培養基時應注意成分的適當分組與加入(jiā rù)的順序。如將磷(P)、鈣和鐵放在**后加入。
　　(4)注意高壓滅菌(Sterilization)后培養基pH值的變化及回復動態。壓力蒸汽滅菌器具有造型新穎美觀、結構合理、功能齊全、加熱迅速、滅菌*等優點。適用于醫療、科研、食品、等單位對手術器械、敷料、玻璃器皿、橡膠制品、食品、藥液、培養基等物品進行滅菌。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高**6.48。而96h后又回降**5.8左右。這樣在實驗（experiment)中就可以根據這一規律加以掌握。 2.過濾滅菌（不耐熱的物質 ）如一些抗生素類物3.紫外線和熏蒸滅菌（空間）
　　(1)紫外線滅菌：在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線的波長為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力**強，但是由于紫外線的穿透物質的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。在接種前打開紫外燈進間(room)及超凈臺滅菌30min，然后進行接種。
　　(2)熏蒸滅菌：用加熱焚燒、氧化等方法(method)，使化學(huà xué)藥劑變為氣體狀態擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面(appearance)的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳(manganese)酸鉀氧化揮發。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。4.噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%—1%的新潔爾滅也可以。5.植物材料表面用消毒劑滅菌（外植體）從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養基，便會造成培養基污染。因此，植物材料必須(have to)經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上，這一過程叫做接種。**步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘**數小時，沖洗時間視材料清潔(clean)程度而宜。洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便于滅菌液的直接接觸(contact)。當然，**理想的清洗物質是表面活性物質—吐溫。第二步對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。第三步用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1—2種使用(use)見表。常用滅菌劑使用濃度及效果比較表
滅菌劑 使用濃度(%) 持續時間（min） 去除的難易 效果 次氯酸鈣 9～10 5～30 易 很好 次氯酸鈉 2 5～30 易 很好 0.1～1 5～8 較難 **好 抗菌(anti-microbial)素 4～50mg/L 30～60 中 較好
上述滅菌(Sterilization)劑應在使用前臨時配制，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可；用液滅菌的材料，難以對殘毒較難篩除，所以應當用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時，把瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒*。滅菌時間是從倒人消毒液開始，**倒入無菌水時為止。吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。**后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。 
　　二、無菌操作技術
　　一、用品超凈工作臺、75％的酒精、95％的酒精、盛有培養基的培養瓶、接種器械（主要指、剪刀、鑷子等）、酒精燈、培養材料（根、莖、葉或種子等）、0．1％的（或漂白粉）、無菌（fungus)水等。生物安全柜是為操作原代培養物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的。
　　二、方法步驟（一）在接種前4h用甲醛與混合薰蒸接種室，并打開紫外燈照射30min；（二）正式接種前半小時左右，打開超凈工作臺上的紫外燈和風機，20～30min后接種；
　　（三）用肥皂水洗凈雙手，在緩沖間內穿好滅過菌的實驗（experiment)服、帽子與拖鞋，進入接種室；（四）用75％的酒精擦拭工作(gōng zuò)臺面和雙手；（五）用蘸（zhàn)有75％酒精的紗布擦拭裝有培養基的培養器皿，放進工作臺；   
　　（六）把、剪刀、鑷子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上；   
　　（七）把植物材料放進75％的酒精中浸泡約30s，再在0．1％的中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉(化學式Ca(ClO)?)上溶液中浸泡10～15min，浸泡時可進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗3～5次；   
　　（八）用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到，打開封口塑料；   
　　（九）取下接種器械，在火焰上滅菌；   
　　（十）把培養材料(Material)迅速放入培養瓶，扎上瓶口（每人接種5～10瓶）。操作期間應經常用75％酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95％的酒精中浸泡和在火焰上滅菌；   
　　（十一）接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。